Skip to content

Mutacja PHD2 i wrodzona erytrocytoza z Paraganglioma czesc 4

2 miesiące ago

474 words

Aktywność lucyferazy mierzono 24 godziny po transfekcji przy użyciu systemu podwójnie lucyferazowego testu reporterowego (Promega). Do immunoblottingu użyto 15 .l alikwotów lizatów stosowanych w testach lucyferazy i zastosowano przeciwciało anty-HA (F7) (Tebu). Wyniki
Analiza sekwencjonowania i straty heterozykozy
Rycina 2. Rycina 2. Mutacja PHD2 i wyniki analizy utraty nowotworu o heterozyzmie. Panel A pokazuje chromatogram sekwencji egzonu 3 PHD2 w obszarze zmutowanego nukleotydu. Panel B pokazuje wyniki analizy utraty heterozygotyczności na linii germinalnej i DNA nowotworu. Zbadano sześć markerów mikrosatelitarnych, obejmujących 57 Mb regionu 1q42. Ich pozycje względem centromeru i telomeru są wskazane (rysunek nie przedstawia skali). Współczynniki nierównowagi allelicznej (AIR) obliczono dzieląc stosunek wysokości piku dwóch alleli linii zarodkowej przez stosunek wysokości piku dwóch alleli nowotworowych. Wartość AIR mniejsza niż 0,5 oznacza utratę heterozygotyczności, wykazaną przez wszystkie testowane markery. Dla wersji Panelu B, pokazującej specyfikacje każdego piku, zobacz Dodatek Dodatek (dostępny wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org).
Sekwencjonowaliśmy DNA linii zarodkowej otrzymane od pacjenta pod kątem genów, które mogą być związane z wrodzoną czerwienicą związaną z wysokim poziomem erytropoetyny w surowicy: PHD1, PHD2, PHD3 i HIF2A. Zidentyfikowaliśmy unikalną odmianę heterozygotyczną c.1121A . G (p.H374R) w genie PHD2 (Figura 2A). Brak tego wariantu w populacji kontrolnej (w której przetestowano 280 alleli) wykluczył rzadki polimorfizm. Żaden z trzech krewnych pierwszego stopnia pacjenta nie był nosicielem mutacji PHD2. DNA nowotworu pacjenta zsekwencjonowano dla genu PHD2 i wykryto zmutowany allel (Figura 2A). Co ciekawe, chromatogram w pozycji 1121 ujawnił głównie zmutowany allel, co wskazuje na utratę heterozygotyczności PHD2; sygnał resztkowy dla allelu typu dzikiego może być uwzględniony w wyniku zanieczyszczenia przez normalną tkankę. Utratę heterozygotyczności potwierdzono za pomocą analizy mikrosatelitarnej regionu PHD2, która wykazała monotyczność dla wszystkich testowanych markerów (Figura 2B).
Badania funkcjonalne
Rysunek 3. Rysunek 3. Opis i funkcja modyfikatora p.H374R PHD2. H374 aminokwas jest konserwowany wśród izoform ludzkich PHD, a także wśród homologicznych izoform PHD u innych gatunków (panel A). Panel B pokazuje trójwymiarową strukturę białka PHD2 tworząc kompleks z Fe2 + i konkurencyjnym inhibitorem 2-oksoglutaranu (ligand). Obraz wytworzono przy użyciu oprogramowania ligand 3D explorer i oparto na krysztale 2g1m w Banku Danych Białka (www.wwpdb.org). 14 Panel C pokazuje kwantyfikację immunologiczną transfekowanego PHD2. Zmieniające się ilości wektora ekspresyjnego pcDNA3-HA-PHD2 (typu dzikiego lub zmutowanego) transfekowano do komórek 293T. Białka zebrano 24 godziny później i poddano je immunoblottingowi z przeciwciałem anty-HA. Panel D pokazuje wyniki funkcjonalnego badania PHD2 za pomocą testu reporterowego. Komórki kotransfekowano ustaloną ilością pcDNA3-HIF-2. i różnymi ilościami wektorów ekspresyjnych pcDNA3-HA-PHD2, oprócz wektorów reporterowych pGL3 kodujących lucyferazę pod kontrolą elementu odpowiadającego na niedotlenienie genu erytropoetyny i renilla, jako kontrola skuteczności transfekcji
[więcej w: stomatolog zielona góra, dentysta bielsko, chirurgiczne usuwanie ósemek ]

Powiązane tematy z artykułem: chirurgiczne usuwanie ósemek dentysta bielsko stomatolog zielona góra