Skip to content

Mutacja PHD2 i wrodzona erytrocytoza z Paraganglioma cd

2 miesiące ago

472 words

Związek między erytrocytozą a wytwarzaniem erytropoetyny przez nowotwór był jednak wykluczony, ponieważ erytropoetynowy informacyjny RNA nie został znaleziony w testach ekspresji genów (test Taqman, z ludzkimi komórkami raka wątrobowokomórkowego [komórki Hep3B] i guz wywołujący erytropoetynę związany z drugorzędowa policytemia jako kontrola) (dane nie pokazane). Od 2004 r. Do czasu opublikowania tego artykułu stan kliniczny pacjenta pozostał niezmieniony, z niewielkim wzrostem hematokrytu i ciśnienia krwi, oba wymagające leczenia przy pomocy upuszczenia krwi i leków przeciwnadciśnieniowych. Powtarzane skanowanie CT i 131I-metaiodobenzyloguanidyny nie wykryło nawrotu nowotworu, chociaż wydalanie moczu z metanfryn było w tym okresie dwukrotnie wyższe od górnej granicy prawidłowego zakresu. Możliwości choroby VHL lub dziedzicznego zespołu paraganglioma-pheochromocytoma wykluczono przez rutynowe testy genetyczne: nie zidentyfikowano mutacji w linii płciowej w genach VHL, SDHB, SDHC lub SDHD. Metody
Sekwencjonowanie DNA i analiza utraty heterozykozy
Po otrzymaniu zgody od naszej lokalnej komisji etycznej i uzyskaniu pisemnej świadomej zgody od probanda i wszystkich członków rodziny, pobrano próbki krwi do analizy genetycznej. Genomowy DNA ekstrahowano z krwi obwodowej i paraganglioma i oczyszczono na kolumnie z wirowaniem (Qiagen). Badania przesiewowe pod kątem mutacji w genie PHD2 przeprowadzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania (z użyciem zestawu BigDye Terminator v3.1 Kit i analizatora genetycznego ABI 3730, oba z Applied Biosystems). Dane sekwencji dopasowano za pomocą oprogramowania 4Peaks (http://mekentosj.com/4peaks). Sekwencje wszystkich starterów użytych w tym badaniu są podane w Dodatkowym Dodatku, dostępnym wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org. Próbki DNA od osób zdrowych przeszukano pod kątem mutacji c.1121A . G (z testowanymi 280 allelami). Inicoico przewidywanie szkodliwego działania mutanta przeprowadzono na stronie internetowej PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph) oraz na stronie internetowej Panther (www.pantherdb.org).
Do analizy utraty heterozygotyczności analizowano sześć markerów mikrosatelitarnych flankujących gen PHD2 (zlokalizowany w 1q42,1): D1S2877, D1S2833, D1S251, D1S2709, D1S2785 i D1S2836 (zestaw mapowania powiązań ABI PRISM, Applied Biosystems). Amplifikację przeprowadzono za pomocą Multiplex PCR Master Mix (Qiagen), zgodnie z instrukcjami producenta. Amplifikowane fragmenty przeprowadzono na analizatorze genetycznym (ABI 3730). Dane analizowano za pomocą oprogramowania GeneMapper (Applied Biosystems).
Analiza funkcjonalna
Mutację H374R PHD2 wprowadzono do wektora pcDNA3-HA-PHD2 za pomocą ukierunkowanej mutagenezy (Promega). Testy lucyferazy przeprowadzono na ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 293T hodowanych w pożywce Eagle a zmodyfikowanej przez Dulbecco uzupełnionej 10% surowicą płodową cielęcą wysianą w 12-studzienkowych płytkach (2 x 105 komórek na studzienkę) 24 godziny przed transfekcją. Odczynnik transfekcyjny Lipofectamine 2000 (Invitrogen) zastosowano do przejściowych transfekcji. Wektor pcDNA3-HA-HIF-2. lub HIF-1. (100 ng), wektor lucyferazy promotora erytropoetyny pGL3 (200 ng) i wektor pRilla (20 ng) kotransfekowano za pomocą ekspresji PHD2 (mutant typu dzikiego lub H374R) wektor (od 5 do 125 ng)
[hasła pokrewne: leki przeciwbólowe na receptę lista, przewlekły katar krzyżówka, medycyna estetyczna wilanów ]

Powiązane tematy z artykułem: leki przeciwbólowe na receptę lista medycyna estetyczna wilanów przewlekły katar krzyżówka